冻存的原理与应用
当细胞温度降至0°C以下时，会发生脱水现象，导致细胞内可溶性物质浓度增加，同时形成冰晶。冰晶大小对细胞的影响具有差异性，大冰晶容易损伤细胞膜和细胞器，进而显著降低复苏细胞的存活率和状态。因此，在进行细胞冻存时，通常会采取两项关键措施：一是添加低温保护剂，二是实施缓慢冷冻步骤。

合适的冻存时机
细胞在生长状态良好、密度达到80-90%时（一般在106-107/ml）进行冻存效果最佳。活力较差的细胞在冻存后存活率通常较低。

低温保护剂的选择
常用的低温保护剂为二甲基亚砜（DMSO），它作为一种渗透保护剂，能够快速进入细胞，提升细胞膜的水通透性，降低冰点，并延缓冻结速度。这使得细胞内水分能在冻结前排出，从而在细胞外形成冰晶，减少细胞内部冰晶的形成，进而减轻冰晶对细胞的损伤。

细胞的缓慢冷冻
可以使用程序降温盒进行慢速冷冻，以避免生成过大的冰晶。如果没有程序降温设备，细胞可依次放置在4°C（1小时）、-20°C（2小时）和-80°C（过夜）中，大多数细胞也能适应这种冷冻过程。

冻存液的配置
冻存液需提前配制并保持在室温，以避免临时配制产生的热量损害细胞（DMSO与培养基混合时会放热）。常规冻存液比例为培养基：血清：DMSO=7:2:1。如细胞较为珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。

操作步骤
1. 使用移液器吸去原培养基，加入适量PBS清洗1-2遍；
2. 消化细胞：加入适量胰酶，放入37°C的培养箱中消化（在10厘米培养皿中加入1 ml的0.25%胰酶，消化4-5分钟；注意不同细胞的消化时间不同，终止消化的标准是镜下观察80%-90%以上的细胞变圆）；
3. 消化完成后，加入2倍体积的完全培养基以终止消化，并在800-1000 rpm下离心3-5分钟；
4. 准备冻存管，标记日期、细胞类别、负责人和代数。待细胞离心后去上清，加入冻存液重悬，每管1-1.5 ml，然后转移到冻存管中；
5. 将冻存管放入程序降温盒中，置于-80°C过夜，然后转移至液氮中保存。

注意事项
1. 细胞加入冻存液后应立即放入-80°C保存，避免长时间放置于常温；
2. 冻存细胞在-80°C中存储时间通常不建议超过半年，而在液氮中保存不建议超过2年。选择ag尊龙凯时的冻存管理方案，确保细胞的有效保存与复苏。